猪肠外致病性大肠杆菌ompX基因缺失株构建及生物学特性研究

【摘要】肠外致病性大肠杆菌(ExtraintestinalPathogenicE.coli,ExPEC),是一种重要的人畜共患病病原菌,主要通过其特有的毒力因子侵袭定植到人和动物肠道外组织引起疾病。近年来,本实验室从临床中分离到大量猪源性ExPEC,多表现为多重耐药的特性,使得抗生素的治疗效果大大降低,而且由于ExPEC的致病机制尚未阐明,也缺乏有效的疫苗加以控制,给养殖业造成严重的威胁。另外,猪源ExPEC特定的毒力因子、种群、血清型与人ExPEC相似,具有潜在的人类感染风险。为有效控制猪源ExPEC的感染,筛选有效的免疫保护性抗原,研发有效的疫苗,具有重要的意义。OmpX是一种重要的细菌外膜蛋白,属于Ail蛋白家族。该蛋白在其他细菌中参与细菌对细胞的黏附和侵袭,对抗宿主的免疫防御等,且与细菌的毒力有密切关系。因此,被认为有可能作为疫苗开发的候选靶标。本试验以猪源ExPECPCN042为野生株,通过同源重组构建ompX基因缺失株及其回复补偿株,研究其生物学特性,探讨ompX在ExPEC多重耐药性、生物被膜和致病性中的作用。主要研究结果如下：1.ompX基因缺失株及回补株的构建从野生株PCN042基因组扩增ompX基因的上下游同源臂,通过重叠PCR进行连接再与pRE112连接,构建重组转移质粒pREl12△ompX。以含有重组质粒pRE112△ompX的χ7213为供体菌,野生株为受体菌进行双亲本结合转移,利用质粒上的双向筛选标记筛选ompX基因缺失株△ompX。从野生株PCN042基因组中扩增ompX伞长基因,连入穿梭载体pHSG396,构建重组表达质粒pHSG396-ompX,电转化到△ompX缺失株,构建回补株ompX2.ompX基因缺失株的生物学特性研究经PCR鉴定,本试验构建的ompX缺失株在体外连续传代培养,10代内均可稳定遗传。通过测定试验菌株的生长曲线,证实ompX基因缺失不影响ExPEC的生长速率。通过半固体培养条件对试验菌株的运动性进行测定,结果表明,ompX基因缺失株运动能力显著高于野生株；经微孔板法测定试验菌株的生物被膜形成能力,结果表明野生株、缺失株和回补株之间无显著差异。本试验进一步测定了试验菌株对5种抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC),结果显示ompx缺失株对四环素和头孢噻肟的敏感性增加。本试验采用体内和体外实验评价了OmpX对ExPEC毒力的影响。肺上皮细胞和巨噬细胞黏附侵袭实验表明,ompX缺失后细菌对细胞的黏附和侵袭能力均显著下降,但对巨噬细胞内存活能力并无显著影响。体内小鼠实验结果显示,缺失株的LDso为野生株的6.27倍,对缺失株进行补偿后LD50恢复到野生株的60%,证实ompX基因缺失可降低ExPEC的毒力；细菌载量实验结果表明,小鼠感染8h和24h后,缺失株在心、肝和脾的定植能力都显著下降,而在肺和肾的定植能力分别在感染24h和8h时显著低于野生株。因此,体内和体外实验均表明OmpX对于ExPEC的致病性至关重要,可能成为进一步研究ExPEC致病机理和疫苗研发的重要靶抗原。
【作者】张丽媛；
【导师】栗绍文；
【作者基本信息】华中农业大学，预防兽医学，2014，硕士
【关键词】ExPEC；外膜蛋白；ompX；基因缺失；生物学特性；耐药性；致病性；生物被膜；

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